Длительное применение препаратов фиалки трехцветной может вызвать рвоту, понос и зудящую сыпь ()
Надземные части содержат рутин (в листьях – до 0,13%), красящие вещества, эфирное масло, сапонины, каротиноиды, аскорбиновую кислоту (до 300 мг/100 г).
В качестве лекарственного сырья используют траву.
Обладает отхаркивающим, мочегонным, потогонным, противовоспалительным и легким мягчительным действием. Фиалку трехцветную часто используют для лечения кожных заболеваний.